免疫荧光法常规流程和常见问题

 

A. 溶液和试剂

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O，然后将其混匀。注：调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%, 无甲醇，使用新鲜制剂，小瓶打开后避光 4°C 保存。按照 1 比 4 的比例在 1X PBS 中稀释，制成 4% 甲醛溶液。
3. 封闭缓冲液：（1X PBS/5% 正常血清/0.3% X-100）：准备 10 ml 缓冲液，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清并混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
4. 抗体稀释缓冲液：(1X PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100)：准备 10 ml 溶液，添加 30 µl  X-100 到 10 ml 1X PBS 中。混匀后再加入 0.1g BSA，并混匀。
5. 荧光物质标记二抗

B. 标本准备

I. 培养细胞系 (IF-IC)

注：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用温热 PBS 稀释的 4% 甲醛。

   注：甲醛有毒性，仅限通风橱中使用。

2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

II. 冰冻/低温切片 (IF-F)

1. 冰冻固定组织进行免疫染色（C 部分）。
2. 对新鲜未固定的冰冻组织，立刻按下列步骤固定：
   1. 将切片覆盖一层用温热 1X PBS 稀释的 4% 甲醛溶液。
   2. 室温下固定切片 15 分钟。
   3. 用 PBS 漂洗玻片三次，每次 5 分钟。
   4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭标本时，按照数据表中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 孵育过夜。

5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。

   注：如果使用荧光物质标记的一抗，则跳转到 Ｃ部分，第 8 步。

6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
8. 用盖玻片盖住切片。
9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。