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新冠病毒核酸RT-PCR检测

新冠病毒

新型冠状病毒（严重急性呼吸道综合征冠状病毒2，Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2），最初发现于2019年，也可称为2019新型冠状病毒。是乙型冠状病毒中的一个分型，与2003年SARS病毒相似。该病毒株以前从未在人体中发现，人感染后会出现呼吸道症状、咳嗽、发烧、呼吸困难，部分患者嗅觉味觉消失，严重的病例中出现严重的呼吸综合征、肺炎、肺纤维化、肾衰竭，甚至死亡。该病毒主要通过上呼吸道入侵人体，主要感染肺、心脏、肾等多种器官。

该病毒具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约80～120nm。具有包膜的正链单链RNA病毒，较容易突变，目前多种变种在全球发现。

目前病毒检测主要是核酸检测和抗原检测。核酸检测在病毒感染后就可以检测出，是检测病毒感染与否的直接证据，抗原抗体检测是患者感染3d后出现抗体，是检测病毒感染的间接证据。

核酸检测主要是通过实时荧光定量PCR检测新冠病毒保守的片段区域的序列，以确定体内是否含有该病毒。当定量PCR检测出有该序列，说明有可能感染了病毒，会通过多次PCR进行检测并结合临床检测指标进行确诊。

实时荧光定量PCR使用Taqman法进行检测，使用针对病毒2个或更多的保守区域特异性引物和探针（不同国家或地区检测的区域不一致，我国主要是检测ORF1ab和N区域这2个保守区域）

图1 新冠病毒基因组图及PCR靶基因检测区域

图2 核酸检测流程（据Enzolifesciences）

咽拭子样本采集后运送至实验室生物安全柜中直接进行下列处理，样本也可以在4℃冰箱中储存不超过7天。

（1）预处理：样本中加入Remel Sputasol (Thermo Fisher Scientific)对粘性样本进行预处理。

（2）病毒灭活：将50μl样本在99℃加热5min，将病毒灭活。将样本转移至离心机中4000rpm离心5min。（有的试剂盒需要提取核酸）

（3）逆转录+PCR检测：取5μl样本加入逆转录和PCR反应体系中。

反应体系包含：逆转录酶、DNA聚合酶、特异性引物、特异性probe，并使用乙肝病毒HBVS抗原序列作为内控。

PCR mix体系

PCR反应程序

（4）结果判读：

PCR检测结束后，定量PCR仪会有每个样本检测的Ct值，当检测样本两个检测位点无Ct值或者>38时，判断为阴性，当两个检测位点Ct值<38时，是阳性，当两个检测位点Ct值在38左右不一致是，需要再次进行复检。

当Ct值阳性时，医生会结合流行病学接触史和影像学检查结合进行综合判断。

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